亚洲熟女综合色一区二区三区,国产精品福利一区二区,调教済み変态JK扩张调教し,大屁股熟女一区二区三区

產(chǎn)品列表PRODUCTS LIST

首頁 > 技術(shù)與支持 > 解析逆轉(zhuǎn)錄實驗中操作問題
解析逆轉(zhuǎn)錄實驗中操作問題
點擊次數(shù):2384 更新時間:2022-08-01

 

       逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription)實驗作為是常見的分子生物學實驗之一,逆轉(zhuǎn)錄是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程,即 RNA 指導(dǎo)下的 DNA 合成,逆轉(zhuǎn)錄實驗包括3大要素,分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNA 模板。雖然看上去步驟簡單,但是逆轉(zhuǎn)錄實驗中實際操作時常出現(xiàn)問題如下:

1. 如何提高 RT-PCR 反應(yīng)的靈敏度與特異性?

① 確定模板 RNA 完整性好,無 DNA 污染。

RNA 模板中不應(yīng)含有擴增反應(yīng)抑制劑。

③ 使用適量的模板 RNA ,模板量太多會降低特異性,太少會導(dǎo)致擴增不出條帶或條帶太弱。

④ 若模板中有二級結(jié)構(gòu),可通過提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度來提高擴增效果。

 

2.  RNA 中含有逆轉(zhuǎn)錄抑制劑時,怎么處理?

逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括:SDS EDTA 、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽等等??蓪⒁汛_定的高質(zhì)量 RNA 模板同樣品混合,同高質(zhì)量 RNA 模板比較產(chǎn)量以檢測 RNA 抑制劑;若高質(zhì)量模板 RNA 與樣品混合后產(chǎn)量降低,則說明樣品中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑,可用70%v/v)乙醇對 RNA 沉淀進行清洗,以除去抑制劑。

 

3. 逆轉(zhuǎn)錄后的 qPCR 實驗 Ct 值偏大或者普通 PCR 產(chǎn)量低。

RNA 模板質(zhì)量差,需要重新制備 RNA 模板,可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

② 逆轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉(zhuǎn)錄試劑成分,可能會對后續(xù)的PCR 產(chǎn)生抑制作用,所以可以適當梯度提高 cDNA 稀釋比例(通常來說可將 cDNA 原液稀釋5-10倍,其*佳模板加入量以擴增得到的 Ct 值在20-30個循環(huán)為好)。

③ 起始的 RNA 模板量低,需要減少稀釋倍數(shù)或增加 RNA 模板量。

④ 基因本身原因(復(fù)雜和長度),可以重新設(shè)計復(fù)雜基因的引物,避免復(fù)雜結(jié)構(gòu)。或者用三步法程序或延長兩步法程序的延伸時間。

⑤ 逆轉(zhuǎn)錄或者定量產(chǎn)品性能差,可以通過做平行不用品牌產(chǎn)品對比實驗,對比逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品性能。

 

4. 逆轉(zhuǎn)錄酶擴增效率評估,應(yīng)該關(guān)注哪些指標?

建議: qPCR-ct 值,或者 PCR 產(chǎn)量

如果想比較逆轉(zhuǎn)錄性能,尤為直接的還是后續(xù)做 qPCR 或者 PCR 平行對比實驗,這種方法相對較為準確。

不建議:cDNA 中間產(chǎn)物濃度測定 or 其他方法。

逆轉(zhuǎn)錄完成后是不建議測定產(chǎn)物濃度的,由于逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生 RNA-cDNA 雜交鏈,溶液中的 RNA 和部分 DNA 會對吸光值產(chǎn)生影響,所以測定出來的產(chǎn)物濃度并不準確,即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的試劑盒進行對比實驗,由于不同品牌之間的逆轉(zhuǎn)錄體系具有或多或少的差異,其體系中的各種離子等都能對吸光度產(chǎn)生影響,所以測定的結(jié)果也沒有可比性。

 

優(yōu)化及注意事項:

1、 逆轉(zhuǎn)錄 PCR 時,提取 RNA 是關(guān)鍵,需分離高質(zhì)量 RNA(純度和完整性)。

2 整個操作過程需使用去 RNA 酶的槍頭、EP 管等耗材。

3 逆轉(zhuǎn)錄過程中要謹防 RNA 酶的污染,加入 RNA 酶抑制劑。

4 為了防止非特異性擴增,必須設(shè)陰性對照。

5 逆轉(zhuǎn)錄實驗應(yīng)全程在冰上操作完成,操作過程應(yīng)避免 RNase 污染。

6、 提高逆轉(zhuǎn)錄預(yù)熱溫度(也可根據(jù)相應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行調(diào)整)。

7 減少基因組 DNA 污染,可使用去基因組的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。

 

色欲AV永久无码精品无码蜜桃 | 狠狠人妻久久久久久综合| 西西人体自慰GOGO| 一本色道久久HEZYO无码| 小少爷撅着屁股挨C双龙若| 国产精品18久久久久久白浆.| 国产又粗又黄又爽又硬的图片| 亚洲精品久久久久AV无码| 精品国精品国产自在久国产| 3D动漫精品啪啪一区二区| 4P调教三根一起男男| 日本午夜精品一区二区三区电影| 广东少妇大战黑人34厘米视频| 被黑人猛烈进出到抽搐动态图| 国产欧美VA欧美VA香蕉在| 年轻教师6电影完整版| 彩虹网免费视频在线观看| 超爆乳中文字幕巨爆乳 | 欧美一区二区三区| 亚洲精品国产精品乱码不卡√| 97人妻精品全国免费视频| 青青草国产成人99久久| 中国帅气体育生GARY| 亚洲精品乱码久久久久久V| 无遮掩60分钟从头啪到尾| 欧美性XXXXX极品少妇| 久久蜜桃国产TV一区二区| 又大又粗又爽A级毛片免费看| 国产又粗又猛又黄又爽无遮挡| 国产又爽又黄又爽又刺激| 国产色爱AV资源综合区| 免费无码又爽又高潮视频| 久久久久亚洲精品男人的天堂 | 久久99国产精品久久| 中文无码精品A∨在线观看不卡| 天天躁日日躁狠狠躁AV麻豆| 理论片87福利理论电影| 国精品人妻无码一区二区三区在线 | 老公的朋友跟我做完就不理我| 亚洲AV成人无码久久精品老人| 亚洲愉拍99热成人精品|